提示：

 

    次使用前請(qǐng)先在漂洗液RW瓶和70%乙醇瓶中加入指定量無(wú)水乙醇!

 

    操作前在裂解液RLT中加入β-巰基乙醇至終濃度1%，如1mlRLT中加入10μlβ-巰基乙醇。此裂解液現(xiàn)用現(xiàn)配。配好的RLT4℃可放置一個(gè)月。

 

    1.組織培養(yǎng)細(xì)胞

 

    a.收集<107懸浮細(xì)胞到一個(gè)1.5ml離心管，對(duì)于貼壁細(xì)胞，孔板培養(yǎng)可以直接裂解，細(xì)胞瓶培養(yǎng)應(yīng)該先用胰蛋白酶消化后吹打下來(lái)收集。

 

    b.13，000rpm離心10秒（或者300g離心5分鐘），使細(xì)胞沉淀下來(lái)。完全吸棄上清，留下細(xì)胞團(tuán)，注意不完全棄上清會(huì)稀釋裂解液導(dǎo)致產(chǎn)量純度降低。

 

    c.輕彈管壁將細(xì)胞沉淀完全松散重懸，加入350μl（<5x106細(xì)胞）或者600μl（5x106-1x107細(xì)胞）裂解液RLT，吹打混勻后用手劇烈振蕩20秒，充分裂解。

 

    d.用帶鈍針頭的一次性1ml（配0.9mm針頭）注射器抽打裂解物5-10次或直到得到滿意勻漿結(jié)果（或者電動(dòng)勻漿30秒）,可以剪切DNA,降低粘稠度和提高產(chǎn)量。

 

    e.接操作步驟項(xiàng)下3。

 

    2.動(dòng)物組織（例如鼠肝腦）

 

    a.電動(dòng)勻漿：新鮮組織用解剖刀迅速切成小碎塊,加入350μl（<20mg組織）或者600μl（20-30mg組織）的裂解液RLT后電動(dòng)徹底勻漿20-40秒。

 

    b.液氮研磨+勻漿：在液氮中研磨組織成細(xì)粉后，取適量組織細(xì)粉（20mg/30mg）轉(zhuǎn)入裝有350μl/600μl組織裂解液RLT的1.5ml離心管中,用手劇烈振蕩20秒，充分裂解。用帶鈍針頭的一次性1ml（配0.9mm針頭）注射器抽打裂解物10次或直到得到滿意勻漿結(jié)果（或者電動(dòng)勻漿30秒）,可以剪切DNA,降低粘稠度和提高產(chǎn)量。

 

    c.將勻漿后裂解物13，000rpm離心3分鐘,沉淀可能存在的裂解困難的碎片或者不溶物,將裂解物上清小心轉(zhuǎn)到一個(gè)新離心管。

 

    d.接操作步驟項(xiàng)下3。

 

    3.較精確估計(jì)裂解物（上清）體積,加入等體積的70%乙醇（請(qǐng)先檢查是否已加入無(wú)水乙醇!）,此時(shí)可能出現(xiàn)沉淀,但是不影響提取過(guò)程,立即吹打混勻,不要離心。

 

    4.立刻將混合物（每次小于700μl,多可以分兩次加入）加入一個(gè)吸附柱RA中，（吸附柱放入收集管中）13,000rpm離心60秒，棄掉廢液。

 

    5.加700μl去蛋白液RW1，室溫放置30秒，12，000rpm離心30秒，棄掉廢液。

 

    如果DNA殘留明顯,可在加入RW1后室溫放置5分鐘再離心。

 

    6.加入500μl漂洗液RW（請(qǐng)先檢查是否已加入無(wú)水乙醇!），12,000rpm離心30秒，棄掉廢液。加入500μl漂洗液RW,重復(fù)一遍。

 

    7.將吸附柱RA放回空收集管中，13,000rpm離心2分鐘，盡量除去漂洗液,以免漂洗液中殘留乙醇抑制下游反應(yīng)。

 

    8.取出吸附柱RA，放入一個(gè)RNasefree離心管中，根據(jù)預(yù)期RNA產(chǎn)量在吸附膜的中間部位加30-50μlRNasefreewater（事先在70-90℃水浴中加熱可提高產(chǎn)量），室溫放置1分鐘，12,000rpm離心1分鐘。

 

    9.如果預(yù)期RNA產(chǎn)量>30μg,加30-50μlRNasefreewater重復(fù)步驟8,合并兩次洗脫液,或者使用次的洗脫液加回到吸附柱重復(fù)步驟一遍（如果需要RNA濃度高）。

 

    洗脫兩遍的RNA洗脫液濃度高,分兩次洗脫合并洗脫液的RNA產(chǎn)量比前者高15–30%,但是濃度要低,用戶根據(jù)需要選擇。