1.融解ripa裂解液，混勻。取恰當(dāng)量的裂解液，在運(yùn)用前數(shù)分鐘內(nèi)參加pmsf，使pmsf的終濃度為1mm。

 

    2.關(guān)于貼壁細(xì)胞：去除培養(yǎng)液，用pbs、生理鹽水或無血清培養(yǎng)液洗一遍(假如血清中的蛋白沒有干擾，能夠不洗)。按照6孔板每孔參加150-250微升裂解液的份額參加裂解液。用槍吹打數(shù)下，使裂解液和細(xì)胞充沛接觸。一般裂解液接觸細(xì)胞1-2秒后，細(xì)胞就會(huì)被裂解。

 

    關(guān)于懸浮細(xì)胞：離心收集細(xì)胞，用手指把細(xì)胞用力彈散。按照6孔板每孔細(xì)胞參加150-250微升裂解液的份額參加裂解液。再用手指輕彈以充沛裂解細(xì)胞。充沛裂解后應(yīng)沒有明顯的細(xì)胞沉積。假如細(xì)胞量較多，必需分裝成50-100萬細(xì)胞/管，然后再裂解。

 

    3.充沛裂解后，10000-14000g離心3-5分鐘，取上清，即可進(jìn)行后續(xù)的page、western和免疫沉積等操作。 

 

    裂解液用量說明：一般6孔板每孔細(xì)胞參加150微升裂解液現(xiàn)已足夠，但假如細(xì)胞密度十分高能夠恰當(dāng)加大裂解液的用量到200微升或250微升。 

 

    關(guān)于安排樣品： 

 

    1.把安排剪切成細(xì)微的碎片。

 

    2.融解ripa裂解液，混勻。取恰當(dāng)量的裂解液，在運(yùn)用前數(shù)分鐘內(nèi)參加pmsf，使pmsf的終濃度為1mm。

 

    3.按照每20毫克安排參加150-250微升裂解液的份額參加裂解液。(假如裂解不充沛能夠恰當(dāng)增加更多的裂解液，假如需求高濃度的蛋白樣品，能夠恰當(dāng)減少裂解液的用量。)

 

    4.用玻璃勻漿器勻漿，直至充沛裂解。

 

    5.充沛裂解后，10000-14000g離心3-5分鐘，取上清，即可進(jìn)行后續(xù)的page、western和免疫沉積等操作。

 

    6.假如安排樣品本身十分細(xì)微，能夠恰當(dāng)剪切后直接參加裂解液裂解，通過激烈vortex使樣品裂解充沛。然后同樣離心取上清，用于后續(xù)試驗(yàn)。直接裂解的優(yōu)點(diǎn)是比較方便，不用運(yùn)用勻漿器，缺陷是不如運(yùn)用勻漿器那樣裂解得比較充沛。 

 

    注：ripa裂解液的裂解產(chǎn)品中經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)一小團(tuán)通明膠狀物，屬正�，F(xiàn)象。該通明膠狀物為含有基因組dna等的復(fù)合物。在不檢測和基因組dna結(jié)合特別緊密的蛋白的情況下，能夠直接離心取上清用于后續(xù)試驗(yàn)；假如需求檢測和基因組結(jié)合特別緊密的蛋白，則能夠通過超聲處理打碎打散該通明膠狀物，隨后離心取上清用于后續(xù)試驗(yàn)。假如檢測一些常見的轉(zhuǎn)錄因子，例如nf-kappab、p53等時(shí)，一般不用進(jìn)行超聲處理，就能夠檢測到這些轉(zhuǎn)錄因子。