一、ELISA操作前準(zhǔn)備工作

 

試劑盒的選擇：ELISA操作前，應(yīng)做好實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)、選擇適合自己檢測(cè)范圍和靈敏度的試劑盒，如恒遠(yuǎn)生物高敏ELISA，提前訂購和準(zhǔn)備試劑及耗材、處理樣本等準(zhǔn)備工作。

 

樣本處理：在收集標(biāo)本前需有一個(gè)完整的計(jì)劃，需要清楚要檢測(cè)的成份是否足夠穩(wěn)定。ELISA檢測(cè)提倡新鮮標(biāo)本盡早檢測(cè)，對(duì)收集后當(dāng)天就進(jìn)行檢測(cè)的標(biāo)本，及時(shí)儲(chǔ)存在4℃?zhèn)溆�，如有特殊原因需要周期收集�?biāo)本，請(qǐng)取材后，將標(biāo)本及時(shí)分裝后放在-20℃或-70℃條件下保存。因冰室與室溫存在一定溫差，蛋白極易降解，直接影響實(shí)驗(yàn)質(zhì)量，所以避免反復(fù)凍融。

 

二、ELISA標(biāo)準(zhǔn)品溶解

 

標(biāo)準(zhǔn)品是試劑盒的檢測(cè)抗原的一個(gè)度量標(biāo)尺，因此標(biāo)準(zhǔn)品的溶解、倍比稀釋和保存要特別注意以下細(xì)節(jié)：凍干標(biāo)準(zhǔn)品溶解按照說明書的要求，準(zhǔn)確復(fù)溶。在冰上操作標(biāo)準(zhǔn)品為佳，靜止5-10分鐘，輕輕搖勻后按照一次量分裝，在-20度或-70度保存。標(biāo)準(zhǔn)品嚴(yán)禁反復(fù)凍融。標(biāo)準(zhǔn)品的倍比稀釋應(yīng)事先做好準(zhǔn)備，如離心管的準(zhǔn)備和編號(hào)以及稀釋液的準(zhǔn)備;稀釋時(shí)，應(yīng)充分混勻;采用進(jìn)口或者硅化的EP管，減少蛋白吸附。在實(shí)驗(yàn)孔內(nèi)進(jìn)行倍比稀釋時(shí)，注意操作規(guī)范，槍頭勿刮劃預(yù)包被的孔底。

 

三、ELISA操作中的洗滌

 

洗滌是ELISA實(shí)驗(yàn)中是最多次數(shù)的操作，也是非常重要的步驟。不嚴(yán)格的洗滌容易出現(xiàn)洗不干凈或交叉污染現(xiàn)象，實(shí)驗(yàn)重復(fù)效果差的現(xiàn)象。不管用多道加樣器、洗瓶、吸管，還是洗板機(jī)，嚴(yán)格按照說明書操作不要減少步驟洗滌的洗滌體積、洗滌時(shí)間和洗滌次數(shù)。注意標(biāo)準(zhǔn)化操作將減少實(shí)驗(yàn)誤差和不同實(shí)驗(yàn)之間的誤差。

 

a)洗液不要溢出孔外，以免污染相鄰的孔，特別是每次洗板的前兩遍，若高濃度的孔污染了低濃度的孔或空白孔，其造成的交叉污染的孔是洗不掉的，背景肯定會(huì)增高。

 

b)特別注意：設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)的時(shí)候要考慮實(shí)驗(yàn)孔的位置，保證甩掉洗液時(shí)，空白孔、低濃度孔或陰性對(duì)照組在上面或一側(cè)或分開最好。同時(shí)注意甩掉洗液的動(dòng)作翻轉(zhuǎn)(從正上方旋轉(zhuǎn)120-150度)要迅速、干脆。甩板不要手腕左右搖擺、旋轉(zhuǎn)來甩液體!甩出后以直線方式補(bǔ)2-3次甩出液體。

 

c)用干凈的濾紙，不要用衛(wèi)生紙，因?yàn)榧?xì)小粉塵或者碎屑容易吸附到孔底，導(dǎo)致洗板不干凈，結(jié)果偏高或偏低，重復(fù)孔的數(shù)值也會(huì)相差很大。

 

d)每次拍板不要重復(fù)在一個(gè)地方拍，特別是洗去酶的步驟;拍板不宜過輕，否則拍不干凈，拍板很用力不會(huì)對(duì)蛋白有什么影響。但注意不要太重，以至把板條給拍斷。每次洗板后輕叩幾下，最后一次一定要扣干凈。

 

e)不能減少洗液體積、洗板時(shí)間和次數(shù)。洗板時(shí)間太短，洗板效果不佳。延長(zhǎng)洗板時(shí)間和增加洗板次數(shù)可以使背景更干凈。

 

四、ELISA的標(biāo)準(zhǔn)曲線如何擬合?

一般情況按照說明書推薦方法擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線可以由酶標(biāo)儀附帶軟件自動(dòng)生成，也可手動(dòng)制作。標(biāo)準(zhǔn)曲線呈“S”形曲線，兩端趨于水平，中間趨于線性，中間部分為較佳的檢測(cè)范圍。當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)品的量超過與包被抗體結(jié)合的量，此時(shí)標(biāo)準(zhǔn)品已飽和，再增加標(biāo)準(zhǔn)品的量，其OD值不再變化，故當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)品達(dá)到一定濃度后，曲線就趨于水平。一般給出的濃度范圍落在中間線性范圍，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以測(cè)出樣本的濃度。按照科學(xué)分析方法，如果存在“奇異點(diǎn)”或者“污點(diǎn)”，直接采用線性分析不是很好，要對(duì)擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線的幾個(gè)點(diǎn)進(jìn)行取舍，同時(shí)也可改用雙對(duì)數(shù)直線擬合或者四因素曲線擬合。

 

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