01.pH
多數(shù)細(xì)胞系在pH7.4下生長得很好,盡管如此各細(xì)胞株之間,細(xì)胞生長最佳pH值還是會有一定差異。一些正常的成纖維細(xì)胞系在pH 7.4~7.7牛長最好,而一些轉(zhuǎn)化細(xì)胞系在pH 7.0~7.4更合適。據(jù)報(bào)道,上皮細(xì)胞可在pH 5.5維持。為確定最佳pH值,最好做一個(gè)簡單的生長實(shí)驗(yàn)或特殊功能分析。
酚紅常用作pH指示劑。pH 7.4呈紅色,pH 7.0變橙色, pH6.5變黃色, pH 7.6紅色中略帶藍(lán)色,pH 7.8呈紫色。
02.緩沖
細(xì)胞培養(yǎng)基要在兩種條件下有一定的緩沖作用:一是開放式培養(yǎng)條件下,CO2的釋放引起pH升高;二是細(xì)胞在高密度下,轉(zhuǎn)化細(xì)胞系大量產(chǎn)生CO2和乳酸,引起pH下降。為了穩(wěn)定pH值,可以加入緩沖物。
盡管碳酸氫鈉緩沖系統(tǒng)在生理pH下的緩沖能力差,但由于它毒性小,成本低,對培養(yǎng)物有營養(yǎng)作用,所以它仍比其他緩沖系統(tǒng)使用得多。HEPES在pH 7.2~7.6緩沖作用比其他緩沖系統(tǒng)強(qiáng)很多,現(xiàn)在廣泛采用的濃度是10 mmol/L或20 mmol/L。
03.滲透壓
多數(shù)培養(yǎng)細(xì)胞對滲透壓有很寬的耐受范圍。人細(xì)胞漿的滲透壓是約290 mOsm/kg,因而推測這是體外人細(xì)胞的最佳值,這與其他物種的細(xì)胞不同(如小鼠約是310 mOsm/ kg)。實(shí)際上,大多數(shù)細(xì)胞在260~320 mOsm/kg之間完全可行。更高的滲透壓通常會使細(xì)胞生長速率減緩,但也可使蛋白產(chǎn)物的合成速率加快。因此,有文獻(xiàn)報(bào)道可將細(xì)胞培養(yǎng)基滲秀壓提高到360 mOsm/kg,以提高單克隆抗體產(chǎn)量。
04.溫度
溫度除了對細(xì)胞生長有直接作用之外,也會影響pH。這是因?yàn)榈蜏叵?/span>CO2溶解度增加,緩沖劑的離子化和pKa上的變化,細(xì)胞培養(yǎng)基的pH值也隨之發(fā)生變化。室溫下應(yīng)調(diào)節(jié)到比36.5 ℃下低0.2個(gè)pH單位。第一次配培養(yǎng)基時(shí),最好將培養(yǎng)基加入血清,在36.5℃下和合適的氣體條件下培養(yǎng)樣品過夜,檢查pH。
05.黏度
細(xì)胞培養(yǎng)基的黏度主要受血清含量的影響,多數(shù)情況下,對細(xì)胞生長沒有影響。但當(dāng)細(xì)胞懸浮液需要攪拌時(shí)(如懸浮培養(yǎng)物被攪拌或者胰蛋白酶消化后解離細(xì)胞時(shí)),細(xì)胞培養(yǎng)基的黏度就是一個(gè)重要的影響因素。黏度大,細(xì)胞受損小。若在攪拌時(shí)細(xì)胞受到損害,可以用羧甲基纖維素、聚乙二醇或聚乙烯基吡咯烷酮增加培養(yǎng)基的黏度,減輕細(xì)胞損害。在低血清濃度或無血清下,這一點(diǎn)特別重要。
06.表面張力和泡沫
細(xì)胞培養(yǎng)基的表面張力可促進(jìn)培養(yǎng)物貼附到介質(zhì)上,但很少用某種方法控制它。懸浮培養(yǎng)時(shí),用含5% CO2的空氣在含血清培養(yǎng)基中鼓泡,會產(chǎn)生泡沫。加入硅油消泡劑降低表面張力,有助于防止泡沫生成。
泡沫的作用還不清楚。但泡沫會使蛋白質(zhì)的變性速率增加;如果泡沫達(dá)到培養(yǎng)容器的頸部,也增加了污染的危險(xiǎn)。泡沫在液面上的破碎過程是能量快速釋放的過程,會造成細(xì)胞的嚴(yán)重傷害。細(xì)胞的輕度疏水性促使細(xì)胞在氣泡上升過程中向氣一液界面聚集,并隨氣泡上升至液面,在氣泡破碎時(shí),加重了對細(xì)胞的傷害,如果泡沫很穩(wěn)定,還會造成泡沫中細(xì)胞的營養(yǎng)缺乏。懸浮細(xì)胞培養(yǎng)過程中,必須考慮氣泡的作用,通常用改變通氣方法或加入保護(hù)劑的方法來減少對細(xì)胞的損傷。
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