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植物蛋白提取實(shí)驗(yàn)說明
發(fā)布時(shí)間:2023/9/6 15:59:05 已瀏覽次數(shù): 301 次

植物蛋白提取試劑適用于多種植物根,莖,葉及果實(shí)等的新鮮或凍存組織。植物組織成分復(fù)雜,含有較多酚類物質(zhì)、多糖、色素、次生代謝物質(zhì)等,致使植物蛋白質(zhì)的分離提取變得困難和復(fù)雜。本試劑采用優(yōu)化的試劑和程序,能有效提取多種植物中的可溶性和疏水性蛋白成分,有效去除植物組織所含的多酚、多糖、醌、色素、脂質(zhì)、次生代謝物質(zhì)等干擾蛋白質(zhì)研究的成分,使提取的蛋白質(zhì)處于蕞佳的活性狀態(tài)和檢測狀態(tài),適應(yīng)于酶學(xué)活性測定,單向及雙向蛋白電泳,Western Blot和免疫共沉淀分析等蛋白質(zhì)研究實(shí)驗(yàn)。

 

組成和規(guī)格:無色透明的提取試劑50 ml100 ml。

貯存:4°C,密封避光1年。

用途:提取多種植物組織和細(xì)胞的可溶性和疏水性蛋白。如蘋果、花生、土豆、煙葉、菠菜、梅花等。

 

操作步驟:

1. 組織勻漿,必須充分勻漿,此步驟非常關(guān)鍵:

(1) 凍存組織勻漿:預(yù)先將研缽置于-20°C ~70°C冰箱內(nèi)冷凍。取液氮凍存的植物組織,放入冰凍的研缽內(nèi)研磨至粉末狀,注意使組織一直處于冰凍狀態(tài),如組織顏色加深或變黑通常表明組織已融化。將研磨好的組織轉(zhuǎn)移到EP 管中,按每200 mg植物組織加500 ul的比例加提取試劑,混勻后冰上放置20分鐘,其間可數(shù)次顛倒混勻,以便蛋白溶解。

(2) 新鮮組織勻漿:取新鮮組織放入研缽中,按每200 mg植物組織加500ul的比例加提取試劑,充分研磨使勻漿液中看不到大的塊狀或片狀組織,保證組織研磨破碎。轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi),冰上放置20分鐘。

2. 離心:12000 g離心15分鐘,棄去沉淀。蛋白在上清中。

3. 取離心后的上清,轉(zhuǎn)移至新管,立即使用或-70°C凍存。通常上清內(nèi)植物色素已基本去除,如有少量殘留亦不影響蛋白定量及電泳實(shí)驗(yàn)。建議用BCA方法進(jìn)蛋白定量(我公司的BCA蛋白定量試劑盒#P1511)。

 

如進(jìn)行雙向電泳或欲徹底清除色素等雜質(zhì)可進(jìn)行以下內(nèi)驟:

1. 取上清液加入4倍體積的丙酮或甲醇混勻,-20°C至少一小時(shí)以充分沉淀蛋白質(zhì)。

2. 12000 g離心15分鐘沉淀蛋白。

3. 棄去上清。自然干燥蛋白沉淀,依據(jù)試驗(yàn)將沉淀溶于相應(yīng)的緩沖液。如進(jìn)行Western Blot 亦可用提取試劑溶解。

 

常見問題及解決方法:

1. 提取的蛋白量少:

1) 組織蛋白含量較少,如水果等,可增加組織量;

2) 組織勻漿不充分,如纖維較多的組織,破碎較困難,應(yīng)適當(dāng)延長勻漿時(shí)間;

3) 組織過老或水分丟失致使其干燥,故盡量選用新鮮較嫩的組織;

4) 甲醇或丙酮沉淀后蛋白溶解不充分,應(yīng)延長溶解時(shí)間或使用較強(qiáng)的蛋白溶解劑。

 

2. 蛋白質(zhì)量不佳:

1)提取的蛋白有多酚或色素等雜質(zhì)殘留,可重復(fù)用丙酮或甲醇沉淀;

2) 蛋白質(zhì)降解,操作各步驟均應(yīng)在冰上進(jìn)行;加入蛋白酶抑制劑。

 

 

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