【目的】
掌握BCA法測定蛋白質(zhì)濃度的原理。
【原理】
BCA(bicinchonininc acid)與二價銅離子的硫酸銅等其他 試劑 組成的 試劑 ,混合一起即成為蘋果綠,即BCA工作試劑。在堿性條件下,BCA與蛋白質(zhì)結(jié)合時,蛋白質(zhì)將Cu2+ 還原為Cu+ ,一個Cu+ 螯合二個BCA分子,工作試劑由原來的蘋果綠形成紫色復(fù)合物,最大光吸收強度與蛋白質(zhì)濃度成正比。
【操作】
標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:取 試管 七支、編號,按下表操作:
【計算】
(一) 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
(二) 以測定管吸光度值,查找標(biāo)準(zhǔn)曲線,求出待測血清中蛋白質(zhì)濃度(g/L)。
(三) 再從標(biāo)準(zhǔn)管中選擇一管與測定管光密度相接近者,求出待測血清中蛋白質(zhì)濃度(g/L)。
【優(yōu)缺點】
(一) 操作簡單,快速,45分鐘內(nèi)完成測定,比經(jīng)典的Lowary法快4倍且更加方便;
(二) 準(zhǔn)確靈敏,試劑穩(wěn)定性好,BCA試劑的蛋白質(zhì)測定范圍是20-200μg/ml,微量BCA測定范圍在0.5-10μg/ml。
(三) 經(jīng)濟實用,除 試管 外,測定可在微板孔中就進(jìn)行,大大節(jié)約樣品和試劑用量;
(四) 抗試劑干擾能力比較強,如去垢劑,尿素等均無影響
【器材】
(一) 7220型分光光度計
(二) 恒溫 水浴 箱
(三) 中試管7支
(四) 槍式移液管
【試劑】
1、 試劑A:1%BCA二鈉鹽
2%無水碳酸鈉
0.16%酒石酸鈉
0.4%氫氧化鈉
0.95%碳酸氫鈉
混合調(diào)PH值至11.25。
2、 試劑B:4%硫酸銅。
3、 BCA工作液:試劑A 100ml + 試劑B 2ml混合
4、 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液:用結(jié)晶牛 血清 白蛋白根據(jù)其純度用生理鹽水配制成1.5mg/ml的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液。(純度可經(jīng)凱氏定氮法測定蛋白質(zhì)含量而確定)
5、 待測樣品:用雙縮脲測定法的樣品稀釋而成。
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