簡介:
谷胱甘肽(glutathione,r-glutamyl cysteingl +glycine,GSH)是一種含γ-酰胺鍵和巰基的三肽,由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸組成,存在于幾乎身體的每一個細胞。谷胱甘肽能幫助保持正常的免疫系統(tǒng)功能,并具有抗氧化作用、整合解毒作用 。半胱氨酸上的巰基為其活性基團(故常簡寫為G-SH),易與某些藥物、毒素等結(jié)合,使其具有整合解毒作用。
操作步驟:
一、材料準備
1. 包被液:0.05 mol/l(pH9.6)碳酸鹽緩沖液:Na2CO3 0.159 g,NaHCO3 0.294 g,用蒸餾水溶解后,定容至100 ml。
2. PBS-T洗滌液:0.01mol/ pH7.4磷酸鹽-氯化鈉緩沖液:NaCl 8.0 g,KH2PO4 0.2 g,Na2HPO4·12H2O 2.9 g,KCl 0.2 g,吐溫-20 0.5 ml,用蒸餾水溶解后,定容至1000 ml。
3. 底物溶液3,3’,5,5‘-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)貯存液及應(yīng)用液:
(1)0.1 mol/l pH6.8 PBS:Na2HPO4·12H2O 1.09 g,NaH2PO4·H2O 6.05 g,蒸餾水溶解后定容至500 ml,4℃保存?zhèn)溆谩?/span>
(2)TMB貯備液:TMB 60 mg 溶于10 ml 二甲基亞砜(DMSO)中4℃保存?zhèn)溆谩?/span>
(3)TMB應(yīng)用液:臨用前取0.1 mol/l pH6.0 PBS 10 ml,TMB貯備液100 ul,30%H2O2 15 ul 混勻即可。
二、實驗步驟
1. 抗體包被
(1)抗體用包被液稀釋至20 ug/ml,加入聚苯乙烯反應(yīng)板中每孔100 ul,加蓋后放4℃過夜。
(2)傾去孔內(nèi)液體,加入洗滌液后靜置3 min,傾盡洗滌液,重復(fù)洗滌3次。
(3)將反應(yīng)板口在吸水紙上,以除盡液體。
2. 封閉:每孔加入200 ul封閉液,37℃孵育60 min,然后洗滌3次。
3. 加入待測血清,37℃溫育1~2 h,洗滌3次。用稀釋液作對照孔,標準曲線的制備是用不容稀釋度的純GST-π。
4. 加酶標抗體:按要求稀釋抗GST-π-IgG-HRP,每孔100 ul,37℃溫育1 h,然后洗滌5次,扣在吸水紙上吸干水分。
5. 顯色:加入TMB應(yīng)用液,置室溫反應(yīng)15~30 min,加入50 ul 2 mol/l H2SO4,穩(wěn)定3~5 min,即可比色。
6. 比色:用酶標儀,以PBS-T孔為對照,波長450 nm,測各孔光吸收度(A),查標準曲線,即可測得GST-π含量。
參考文獻:
1.【文獻標題】Tissue engineered artificial liver model based on viscoelastic hyaluronan-collagen hydrogel and the effect of EGCG intervention on ALD
2.【文獻標題】Analysis of the effect of probucol-mecobalamin tablets combination on oxidative stress in patients with diabetic peripheral neuropathy
3.【文獻標題】Effects of sublethal concentrations of cyantraniliprole on the biology and metabolic enzyme activities of Laodelphax striatellus (Fall′en)