蛋白磷酸化是一種非常重要的翻譯后加工，做信號(hào)通路必然是要檢測(cè)蛋白磷酸化的，Western blot是評(píng)估蛋白磷酸化狀態(tài)的最常用方法，其實(shí)和跑正常蛋白沒(méi)什么出入，只不過(guò)孵育的是識(shí)別磷酸化的抗體。下面恒遠(yuǎn)生物帶大家總結(jié)一下實(shí)驗(yàn)中的注意要點(diǎn)。
一、關(guān)于磷酸化蛋白樣品
裂解液?jiǎn)栴}蛋白的磷酸化是一個(gè)非常迅速的反應(yīng)，取樣品的過(guò)程要迅速，樣品要新鮮，樣品處理最好在冰上操作，操作時(shí)間盡量短。用PBS洗滌細(xì)胞時(shí)，PBS一定要4℃預(yù)冷。如果是組織的話，提取蛋白時(shí)采用液氮研磨的方法，研磨器具最好提前預(yù)冷，保持低溫的狀態(tài)。
提取磷酸化蛋白的裂解液最好是新鮮配制，裂解液中一定要有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑，否則即使條帶壓出來(lái)也會(huì)很淺，結(jié)果也不可信。okadaic acid，NaF是磷酸酶抑制劑。再者，還要看你檢測(cè)的蛋白磷酸化位點(diǎn)是什么氨基酸，如果是酪氨酸還要加1 u M的sodium vanidate即原釩酸鈉，上樣前不要煮沸，煮沸可能會(huì)破壞其磷酸化位點(diǎn)。
二、關(guān)于WB時(shí)背景和條帶的問(wèn)題
磷酸化蛋白WB時(shí)背景也往往較深，所以壓片時(shí)間要適當(dāng)，不能太長(zhǎng)或過(guò)短，太長(zhǎng)則背景太深蓋住想要的那條帶，時(shí)間過(guò)短則可能沒(méi)有條帶或者條帶太淺。做磷酸化蛋白WB時(shí)，除了目標(biāo)蛋白的條帶以外，往往會(huì)出現(xiàn)非特異性的條帶。磷酸化抗體不好的話，甚至?xí)䦃撼龇翘禺愋缘臈l帶，反而沒(méi)有你想要的條帶，所以壓片后，一定要根據(jù)Markers比對(duì)一下你壓出的條帶分子量是否正確。
三、關(guān)于蛋白總的表達(dá)量問(wèn)題
研究完某一蛋白的磷酸化情況后最好也要研究一下該蛋白總的表達(dá)量。這有兩種方法，一是：相同的樣品在不同的孔中上樣兩次（可在相同的膠上，也可在不同的膠上），其一壓磷酸化蛋白，另一壓該蛋白總的表達(dá)量（包括磷酸化和未磷酸化的該蛋白），甚至還可跑另一個(gè)膠，壓內(nèi)標(biāo)。但是一般不建議如此做，因?yàn)檫@樣比較時(shí)誤差還是較大的。因此，比較公認(rèn)的，也是常用的方法，即用strip液將原先結(jié)合上的磷酸化抗體及二抗洗去，然后用同一張膜壓總蛋白。然后再洗脫一次，再壓內(nèi)標(biāo)。
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