先把蛋白稀釋一定的倍數(shù),比如說10倍、20倍稀釋(這樣可以大體確定一個(gè)參數(shù)),將抗原進(jìn)行一系列稀釋包被微量反應(yīng)板,再用一定稀釋度的陽性參考血清和陰性參考血清進(jìn)行孵育后洗滌,再加酶結(jié)合物進(jìn)行反應(yīng),經(jīng)孵育洗滌后,加底物溶液顯色,終止反應(yīng)后分別測定o.d值,選擇o.d值≥1.0的那個(gè)抗原稀釋度為zui適包被濃度。一般總是要選擇那個(gè)o.d值稍大于1.0,而不選擇小于1.0的抗原濃度。陰性參考血清o.d值要求<0.1-0.2。也就是要求陽性參考血清和陰性參考血清的o.d值有明顯差別。
在ELISA試劑盒實(shí)驗(yàn)血清為什么要稀釋?有兩個(gè)原因:
1.競爭抑制比較明顯,應(yīng)稀釋競爭物;
2.血清中含有的性腺激素比較低,應(yīng)該濃縮才對。
ELISA試劑盒血清標(biāo)本的保存建議有以下幾點(diǎn):
1.樣本的采集及血清分離中要注意盡量避免細(xì)菌污染,一則細(xì)菌的生長,其所分泌的一些酶可能會(huì)對抗原抗體等蛋白產(chǎn)生分解作用;二則一些細(xì)菌的內(nèi)源性酶如大腸桿菌的β-半乳糖苷酶本身會(huì)對用相應(yīng)酶作標(biāo)記的測定方法產(chǎn)生非特異性干擾。
2.血清標(biāo)本如是以無菌操作分離,則可以在2~8℃下保存一周,ELISA如為有菌操作,則建議冰凍保存。樣本的長時(shí)間保存,應(yīng)在-70℃以下。
3.冰凍保存的血清標(biāo)本須注意避免因停電等造成的反復(fù)凍融。標(biāo)本的反復(fù)凍融所產(chǎn)生的機(jī)械剪切力將對標(biāo)本中的蛋白等分子產(chǎn)生破壞作用,從而引起假陰性結(jié)果。此外,凍融標(biāo)本的混勻亦應(yīng)注意,不要進(jìn)行劇烈振蕩,反復(fù)顛倒混勻即可。
4.要注意避免出現(xiàn)嚴(yán)重溶血。血紅蛋白中含有血紅素基團(tuán),其有類似過氧化物的活性,因此,在以HRP為標(biāo)記酶的測定中,如血清標(biāo)本中血紅蛋白濃度較高,則其就很容易在溫育過程中吸附于固相,從而與后面加入的HRP底物反應(yīng)顯色。
5.標(biāo)本在保存中如出現(xiàn)細(xì)菌污染所致的混濁或絮狀物時(shí),應(yīng)離心沉淀后取上清檢測。
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