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質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的操作步驟你知道嗎
發(fā)布時間:2024/9/5 9:35:05 已瀏覽次數(shù): 180 次

1.基本原理 

將質(zhì)粒 DNA 導(dǎo)入細(xì)菌的過程稱為轉(zhuǎn)化( Transformation )。此感受態(tài)細(xì)菌細(xì)胞在 CaCl 2 低滲溶液中膨脹為球狀(感受態(tài)細(xì)菌的制備,見前)。質(zhì)粒 DNA 與 CaCl 2 形成抗 DNase 羥基 - 磷酸鈣復(fù)合物黏附于細(xì)菌表面,經(jīng) 42℃ 短時間熱沖擊處理,促進細(xì)胞吸收 DNA 復(fù)合物。在豐富培養(yǎng)基上生長數(shù)小時后,球狀細(xì)胞復(fù)原并分裂增殖。被轉(zhuǎn)化的細(xì)菌中,外源基因得到表達。在選擇性培養(yǎng)平板上,可選出所需的轉(zhuǎn)化子(即含有質(zhì)粒 DNA 的細(xì)菌)。鈣處理的感受態(tài)細(xì)胞,一般每微克 DNA 能獲得 10 5 ~ 10 6 個轉(zhuǎn)化子。除化學(xué)方法轉(zhuǎn)化細(xì)菌外,還有電穿孔法( Electroporation ),其轉(zhuǎn)化率可高達 10 9 ~ 10 10 個轉(zhuǎn)化子 /μg 質(zhì)粒 DNA 。
 
2.器材 
①培養(yǎng)皿  ②恒溫培養(yǎng)箱
 
3.試劑 
① LB 培養(yǎng)基
②選擇性 LB 瓊脂培養(yǎng)平板(含氨芐青霉素,終濃度為 50μg/ml )
③氨芐青霉素 100 mg/ml
④宿主細(xì)菌:經(jīng) 100 mmol/L CaCl 2 處理的感受態(tài)細(xì)菌 DH5α
 
4.操作步驟 
①取 50 μL 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞,加入適量質(zhì)粒(體積不得超過 4 μL )冰浴 30 min 后, 42℃ 熱激 90 s ,馬上放回冰上,冰浴 2 min ;
②加 400 μL LB 培養(yǎng)基,于 37℃ 搖床慢搖振蕩培養(yǎng) 45-60 min ;
③取 50-100 μL 涂在含有氨芐青霉素( 100 μg/mL )的 LB 固體培養(yǎng)基上, 37℃ 倒置培養(yǎng)過夜。
 
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