人類多能干細(xì)胞條件培養(yǎng)基

產(chǎn)品貨號(hào)：Cat.No.:AC-1001000

產(chǎn)品基本信息

產(chǎn)品簡(jiǎn)介

人類多能干細(xì)胞（ES/iPS）條件培養(yǎng)基是埃澤思生物科技有限公司（Applied Cell^TM）自主研發(fā)的一款無外源動(dòng)物成分、化學(xué)成分明確且適用于無滋養(yǎng)層培養(yǎng)的人類多能干細(xì)胞培養(yǎng)基。該產(chǎn)品適用于Essential8系統(tǒng)培養(yǎng)的干細(xì)胞(hES/hiPS)，可應(yīng)用于干細(xì)胞傳代，內(nèi)含干細(xì)胞保護(hù)因子，防止細(xì)胞的凋亡、分化，對(duì)細(xì)胞具有良好的保護(hù)作用。GMP級(jí)別生產(chǎn)車間，嚴(yán)格執(zhí)行cGMP操作標(biāo)準(zhǔn)，各項(xiàng)指標(biāo)優(yōu)于行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。

產(chǎn)品特性

l 無需飼(滋)養(yǎng)層（細(xì)胞）。

l 成分明確，批間差小。

l 適用于Essential 8系統(tǒng)培養(yǎng)的人類多能干細(xì)胞。

l 無外源動(dòng)物成分，大大降低各類病毒、霉菌和支原體等的污染風(fēng)險(xiǎn)。

產(chǎn)品內(nèi)容

相關(guān)產(chǎn)品

即用型基質(zhì)膠（Applied Cell^TM: AC-1001007）

人類多能干細(xì)胞無酶消化液（Applied Cell^TM: AC-1001008）

Serum-Free干細(xì)胞高效凍存液（Applied Cell^TM:AC-1001011/AC-1001012）

實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

人類多能干細(xì)胞條件培養(yǎng)基配制

1）2-8℃解凍hPSC Condition Medium Supplement，溶解后離心并混勻，按實(shí)際用量進(jìn)行分裝，立即使用或儲(chǔ)存于-20~ -80℃，避免反復(fù)凍融；

2）按1:50的比例將hPSC Condition Medium Supplement加入到hPSC Condition Medium

  Basal Medium中，混合均勻即成為人類多能干細(xì)胞條件培養(yǎng)基（AC-1001000）。人類多能干細(xì)胞條件培養(yǎng)基（AC-1001000）可在2-8℃ 穩(wěn)定儲(chǔ)存2周，不建議使用配制已超過2周的人類多能干細(xì)胞條件培養(yǎng)基。

3）人類多能干細(xì)胞條件培養(yǎng)基（AC-1001000）可直接應(yīng)用于人類多能干細(xì)胞的傳代、擴(kuò)增培養(yǎng)，具體操作 方法及其他相關(guān)技術(shù)資料請(qǐng)參考埃澤思生物官網(wǎng)。

操作方法(以下步驟皆應(yīng)在無菌條件下操作)

hPSC細(xì)胞復(fù)蘇

1. 實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備工作：

1.1  基質(zhì)膠鋪板、孵育及平衡：取出6孔板/12孔板，每孔內(nèi)加入1 mL/0.5 mL即用型基質(zhì)膠（AC-1001007），輕輕晃動(dòng)6孔板/12孔板使基質(zhì)膠完全覆蓋皿底，然后置于37℃，5% CO₂培養(yǎng)箱中孵育1h~2h，在實(shí)驗(yàn)前拿出并置于超凈工作臺(tái)/生物安全柜中室溫下平衡20min或2-8℃靜置過夜備用。如果暫時(shí)不用，可用Parafilm封口后2-8℃ 儲(chǔ)存，并于1周內(nèi)使用。

注意：①干細(xì)胞復(fù)蘇過程中的基質(zhì)膠鋪板數(shù)由凍存細(xì)胞密度決定，一支凍存的干細(xì)胞的密度在1×10⁶cells/mL左右，需要6孔板鋪1孔或12孔板鋪2孔基質(zhì)膠；②即用型基質(zhì)膠受熱易發(fā)生沉淀，即用即拿及時(shí)放回4℃冰箱保存且勿用手直接觸碰基質(zhì)膠液面所及的瓶身，防止生成沉淀，影響基質(zhì)膠質(zhì)量。

1.2  實(shí)驗(yàn)試劑平衡：人類多能干細(xì)胞條件培養(yǎng)基（AC-1001000）在實(shí)驗(yàn)前置于室溫中避光平衡30min~1h。

1.3  超凈工作臺(tái)/生物安全柜照射紫外：在實(shí)驗(yàn)前打開紫外燈照射30min進(jìn)行滅菌。

1.4  恒溫水浴鍋準(zhǔn)備：水浴鍋溫度設(shè)置在37℃用于hPSC細(xì)胞復(fù)蘇。

2. 實(shí)驗(yàn)具體操作步驟：

2.1  提前加入人類多能干細(xì)胞條件培養(yǎng)基（AC-1001000）：復(fù)蘇前，先在15mL離心管中加入2~3mL的干細(xì)胞條件培養(yǎng)基備用。

2.2  解凍：將從液氮中取出的凍存管快速浸入37℃溫水中，快速搖動(dòng)，使其在1~2min內(nèi)快速解凍；

注意：細(xì)胞從液氮中拿出的速度要快，盡量減少其暴露在室溫中的時(shí)間。

2.3  離心：凍存管中的凍存液解凍后，將其吸出并緩慢逐滴滴入提前在15mL離心管中加入的干細(xì)胞條件培養(yǎng)基中，將15mL離心管置于低速離心機(jī)中配比平衡后，1000rpm/min離心3min；

2.4  重懸：離心后棄上清加1mL人類多能干細(xì)胞條件培養(yǎng)基（AC-1001000） 對(duì)干細(xì)胞沉淀進(jìn)行吹吸混勻，吹吸3~5次左右。

2.5  接種：吹吸均勻后，將已經(jīng)平衡好的即用型基質(zhì)膠（AC-1001007）棄掉，緩慢吹吸15mL離心管中的細(xì)胞懸液，緩慢吹吸3~5次，待細(xì)胞懸液混勻后，加入到6孔板/12孔板中鋪膠的孔內(nèi)，且補(bǔ)全每孔2 mL/1 mL的培養(yǎng)體系。

2.6  培養(yǎng)：接種后的6孔板/12孔板可以置于倒置相差顯微鏡下觀察接種的干細(xì)胞密度以及細(xì)胞團(tuán)塊大小，呈4個(gè)細(xì)胞以上的團(tuán)塊較合格，水平十字輕輕晃動(dòng)6孔板/12孔板使細(xì)胞均勻分布。并置于37℃，5% CO₂的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，第2天觀察細(xì)胞貼壁情況；

2.7  換液：從復(fù)蘇的時(shí)間開始每24h換液一次。

注意：因培養(yǎng)基中活性成分只足夠維持一天，所以每24h應(yīng)及時(shí)更換新鮮培養(yǎng)基。

hPSC細(xì)胞傳代

1. 實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備工作：

1.1  基質(zhì)膠鋪板、孵育及平衡：同hPSC細(xì)胞復(fù)蘇中基質(zhì)膠鋪板、孵育及平衡操作步驟。

1.2  實(shí)驗(yàn)試劑平衡：人類多能干細(xì)胞條件培養(yǎng)基（AC-1001000）、人類多能干細(xì)胞無酶消化液（AC-1001008 ）以及PBS緩沖液在實(shí)驗(yàn)前置于室溫中避光平衡30min~1h。

1.3  超凈工作臺(tái)/生物安全柜照射紫外：在實(shí)驗(yàn)前打開紫外燈照射30min進(jìn)行滅菌。

2.  實(shí)驗(yàn)具體操作步驟：

2.1  清洗：拿出6孔板/12孔板棄去舊的人類多能干細(xì)胞條件培養(yǎng)基（AC-1001000），貼壁緩慢加入1 mL/0.5 mL PBS緩沖液并輕輕晃動(dòng)，然后沿培養(yǎng)皿邊緣吸去 PBS緩沖液；

2.2  消化：在6孔板/12孔板中加入1 mL/0.5 mL人類多能干細(xì)胞無酶消化液（AC-1001008）使之覆蓋皿底，并置于CO₂培養(yǎng)箱中2~5 min；

注意：消化時(shí)間依據(jù)干細(xì)胞生長(zhǎng)密度，如果密度中等且培養(yǎng)2~3天，消化時(shí)間可以控制在2 min~3min，若密度很大且培養(yǎng)4天以上消化時(shí)間可以控制在3 min~5min，消化時(shí)間快結(jié)束時(shí)可以拿到倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若在顯微鏡下觀察到大部分克隆邊緣以及克隆內(nèi)部細(xì)胞間出現(xiàn)間隙，即刻吸掉無酶消化液停止消化。

2.3  吹打：吸掉人類多能干細(xì)胞無酶消化液（AC-1001008）后，立刻加入平衡好的2mL/1mL人類多能干細(xì)胞條件培養(yǎng)基（AC-1001000），用移液槍扇形吹打培養(yǎng)皿底，吹吸次數(shù)保持在3~5次，使皿底貼附的干細(xì)胞集落脫落，輕柔緩慢吹吸混勻，制成干細(xì)胞懸液，并將其并轉(zhuǎn)移到15mL離心管中；

注意：吹吸皿底細(xì)胞的力度要輕柔，吹打脫落和吹吸混勻的次數(shù)在3~5次為宜，盡量避免形成單細(xì)胞。如有少量細(xì)胞無法從皿底脫落，屬于正�，F(xiàn)象。如有大量細(xì)胞無法從皿底脫落，需延長(zhǎng)消化時(shí)間。

2.4  接種：待皿底的細(xì)胞全部吹下并加入到15mL離心管后，將已經(jīng)平衡好的即用型基質(zhì)膠（AC-1001007）棄掉，緩慢吹吸15mL離心管中的細(xì)胞懸液，緩慢吹吸1~2次，待細(xì)胞懸液混勻后，加入到6孔板/12孔板中鋪膠的孔內(nèi)，且補(bǔ)全每孔2mL/1mL的培養(yǎng)體系。

2.5  培養(yǎng)：同hPSC細(xì)胞復(fù)蘇中培養(yǎng)操作步驟；

2.6  換液：從傳代的時(shí)間開始每24h換液一次。

注意：因培養(yǎng)基中活性成分只足夠維持一天，所以每24h應(yīng)及時(shí)更換新鮮培養(yǎng)基。

hPSC細(xì)胞凍存

1. 實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備工作：

1.1  實(shí)驗(yàn)試劑平衡：人類多能干細(xì)胞條件培養(yǎng)基（AC-1001000）、人類多能干細(xì)胞無酶消化液（AC-1001008）以及PBS緩沖液在實(shí)驗(yàn)前置于室溫中避光平衡30min~1h。

1.2  超凈工作臺(tái)/生物安全柜照射紫外：在實(shí)驗(yàn)前打開紫外燈照射30min進(jìn)行滅菌。

2. 實(shí)驗(yàn)具體操作步驟：

2.1  清洗：拿出6孔板/12孔板棄去舊的人類多能干細(xì)胞條件培養(yǎng)基（AC-1001000），貼壁緩慢加入2mL/1mL PBS緩沖液并輕輕晃動(dòng)，然后沿培養(yǎng)皿邊緣吸去 PBS緩沖液；

2.2  消化：同hPSC細(xì)胞傳代中消化操作步驟；

2.3  吹打：同hPSC細(xì)胞傳代中吹打操作步驟；

2.4  離心：待皿底的細(xì)胞全部吹下并加入到15mL離心管后，將15mL離心管置于低速離心機(jī)中配比平衡后，1000 rpm/min離心3 min；

2.5  重懸：離心后棄上清，加入1 mL Serum-free干細(xì)胞高效凍存液（AC-1001011/AC- 1001012）對(duì)干細(xì)胞沉淀進(jìn)行吹吸混勻，吹吸3~5次后，將其加入到1.8mL凍存管中；

注意：凍存液即用即拿，及時(shí)放回4℃冰箱。通常生長(zhǎng)狀態(tài)相同且同時(shí)消化的細(xì)胞統(tǒng)稱為一批細(xì)胞。

2.6  記錄：在凍存管上標(biāo)記凍存細(xì)胞種類、時(shí)間、操作者及細(xì)胞批次。

2.7  -80℃冰箱平衡：凍存管置于-80℃冰箱過夜。

 注意：凍存管放置于-80℃冰箱時(shí)，要將凍存管直立放置，切忌凍存管斜放或橫放。

2.8  液氮凍存：凍存管置于 -80℃冰箱過夜后，第2天將其置于液氮中進(jìn)行長(zhǎng)期保存。

細(xì)胞形態(tài)圖

質(zhì)量控制