人類多能干細胞完全培養(yǎng)基

產(chǎn)品貨號：Cat.No.:AC-1001001

產(chǎn)品基本信息

產(chǎn)品簡介

人類多能干細胞（ES/iPS）完全培養(yǎng)基是埃澤思生物科技有限公司（Applied Cell^TM）自主研發(fā)的一款適用于無滋養(yǎng)層培養(yǎng)，無血清、化學(xué)成分明確，廣泛用于人類胚胎干細胞(ES細胞)和誘導(dǎo)多能干細胞(iPS細胞)培養(yǎng)的完全培養(yǎng)基。該產(chǎn)品適用于Essential 8系統(tǒng)和mTeSR系統(tǒng)培養(yǎng)的，可應(yīng)用于干細胞傳代，內(nèi)含干細胞保護因子，防止細胞的凋亡、分化，對細胞具有良好的保護作用。GMP級別生產(chǎn)車間，嚴(yán)格執(zhí)行cGMP操作標(biāo)準(zhǔn)，各項指標(biāo)優(yōu)于行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。

產(chǎn)品特性

l 成分明確，批間差小

l 無需滋養(yǎng)層細胞

l 內(nèi)含干細胞保護因子，防止干細胞的凋亡、分化

l 適用于E8系統(tǒng)和mTeSR系統(tǒng)培養(yǎng)的人類多能干細胞

產(chǎn)品內(nèi)容

相關(guān)產(chǎn)品

即用型基質(zhì)膠（Applied Cell^TM: AC-1001007）

人類多能干細胞無酶消化液（Applied Cell^TM: AC-1001008）

Serum-Free干細胞高效凍存液（Applied Cell^TM: AC-1001011/AC-1001012）

實驗準(zhǔn)備

人類多能干細胞完全培養(yǎng)基配制

1）2-8℃解凍hPSC Complete Medium Supplement，解凍后輕搖混勻，按實際用量進行分裝，立即使用或儲存于-20~ -80℃，避免反復(fù)凍融；

2）按1:4比例將添加劑加入到hPSC Complete Medium Basal Medium中(100ml添加劑加入400ml基礎(chǔ)培養(yǎng)基中)，混合均勻即為人類多能干細胞完全培養(yǎng)基（AC-1001001）。人類多能干細胞完全培養(yǎng)基可在2-8℃穩(wěn)定儲存2周，不建議使用配制已超過2周的人類多能干細胞完全培養(yǎng)基。

3）人類多能干細胞完全培養(yǎng)基（AC-1001001）可直接應(yīng)用于人類多能干細胞的傳代、擴增培養(yǎng)，具體操作方法及其他相關(guān)技術(shù)資料請參考埃澤思生物官網(wǎng)。

操作方法(以下步驟皆應(yīng)在無菌條件下操作)

hPSC細胞復(fù)蘇

1. 實驗前準(zhǔn)備工作：

1.1  基質(zhì)膠鋪板、孵育及平衡：取出6孔板/12孔板，每孔內(nèi)加入1 mL/0.5 mL即用型基質(zhì)膠（AC-1001007），輕輕晃動6孔板/12孔板使基質(zhì)膠完全覆蓋皿底，然后置于37℃，5% CO₂培養(yǎng)箱中孵育1h~2h，在實驗前拿出并置于超凈工作臺/生物安全柜中室溫下平衡20min或2-8℃靜置過夜備用。如果暫時不用，可用Parafilm封口后2-8℃ 儲存，并于1周內(nèi)使用。

注意：①干細胞復(fù)蘇過程中的基質(zhì)膠鋪板數(shù)由凍存細胞密度決定，一支凍存的干細胞的密度在1×10⁶cells/mL左右，需要6孔板鋪1孔或12孔板鋪2孔基質(zhì)膠；②即用型基質(zhì)膠受熱易發(fā)生沉淀，即用即拿及時放回4℃冰箱保存且勿用手直接觸碰基質(zhì)膠液面所及的瓶身，防止生成沉淀，影響基質(zhì)膠質(zhì)量。

1.2  實驗試劑平衡：人類多能干細胞完全培養(yǎng)基（AC-1001001）在實驗前置于室溫中避光平衡30min~1h。

1.3  超凈工作臺/生物安全柜照射紫外：在實驗前打開紫外燈照射30min進行滅菌。

1.4  恒溫水浴鍋準(zhǔn)備：水浴鍋溫度設(shè)置在37℃用于hPSC細胞復(fù)蘇。

2. 實驗具體操作步驟：

2.1  提前加入人類多能干細胞完全培養(yǎng)基（AC-1001001）：復(fù)蘇前，先在15mL離心管中加入2~3mL的人類多能干細胞完全培養(yǎng)基（AC-1001001）備用。

2.2  解凍：將從液氮中取出的凍存管快速浸入37℃溫水中，快速搖動，使其在1~2min內(nèi)快速解凍；

注意：細胞從液氮中拿出的速度要快，盡量減少其暴露在室溫中的時間。

2.3  離心：凍存管中的凍存液解凍后，將其吸出并緩慢逐滴滴入提前在15mL離心管中加入的人類多能干細胞完全培養(yǎng)基（AC-1001001）中，將15mL離心管置于低速離心機中配比平衡后，1000rpm/min離心3min；

2.4  重懸：離心后棄上清，加入1mL人類多能干細胞完全培養(yǎng)基（AC-1001001）對干細胞沉淀進行吹吸混勻，吹吸3~5次左右。

2.5  接種：吹吸均勻后，將已經(jīng)平衡好的基質(zhì)膠棄掉，緩慢吹吸15mL離心管中的細胞懸液，緩慢吹吸3~5次，待細胞懸液混勻后，加入到6孔板/12孔板中鋪膠的孔內(nèi)，且補全每孔2 mL/1 mL的培養(yǎng)體系。

2.6  培養(yǎng)：接種后的6孔板/12孔板可以置于倒置相差顯微鏡下觀察接種的干細胞密度以及細胞團塊大小，呈4個細胞以上的團塊較合格，水平十字輕輕晃動6孔板/12孔板使細胞均勻分布。并置于37℃，5% CO₂的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，第2天觀察細胞貼壁情況；

2.7  換液：從復(fù)蘇的時間開始每24h換液一次。

注意：因培養(yǎng)基中活性成分只足夠維持一天，所以每24h應(yīng)及時更換新鮮培養(yǎng)基。

hPSC細胞傳代

1. 實驗前準(zhǔn)備工作：

1.1  基質(zhì)膠鋪板、孵育及平衡：同hPSC細胞復(fù)蘇中基質(zhì)膠鋪板、孵育及平衡操作步驟。

1.2  實驗試劑平衡：人類多能干細胞完全培養(yǎng)基（AC-1001001）、人類多能干細胞無酶消化液（AC-1001008 ）以及PBS緩沖液在實驗前置于室溫中避光平衡30min~1h。

1.3  超凈工作臺/生物安全柜照射紫外：在實驗前打開紫外燈照射30min進行滅菌。

2.  實驗具體操作步驟：

2.1  清洗：拿出6孔板/12孔板棄去舊的人類多能干細胞完全培養(yǎng)基（AC-1001001），貼壁緩慢加入1 mL/0.5 mL PBS緩沖液并輕輕晃動，然后沿培養(yǎng)皿邊緣吸去 PBS緩沖液；

2.2  消化：在6孔板/12孔板中加入1 mL/0.5 mL人類多能干細胞無酶消化液（AC-1001008）使之覆蓋皿底，并置于CO₂培養(yǎng)箱中2~5 min；

注意：消化時間依據(jù)干細胞生長密度，如果密度中等且培養(yǎng)2~3天，消化時間可以控制在2 min~3min，若密度很大且培養(yǎng)4天以上消化時間可以控制在3 min~5min，消化時間快結(jié)束時可以拿到倒置顯微鏡下觀察細胞消化情況，若在顯微鏡下觀察到大部分克隆邊緣以及克隆內(nèi)部細胞間出現(xiàn)間隙，即刻吸掉無酶消化液停止消化。

2.3  吹打：吸掉人類多能干細胞無酶消化液（AC-1001008）后，立刻加入平衡好的2mL/1mL干細胞完全培養(yǎng)基（AC-1001001），用移液槍扇形吹打培養(yǎng)皿底，吹吸次數(shù)保持在3~5次，使皿底貼附的干細胞集落脫落，輕柔緩慢吹吸混勻，制成干細胞懸液，并將其并轉(zhuǎn)移到15mL離心管中；

注意：吹吸皿底細胞的力度要輕柔，吹打脫落和吹吸混勻的次數(shù)在3~5次為宜，盡量避免形成單細胞。如有少量細胞無法從皿底脫落，屬于正�，F(xiàn)象。如有大量細胞無法從皿底脫落，需延長消化時間。

2.4  接種：待皿底的細胞全部吹下并加入到15mL離心管后，將已經(jīng)平衡好的即用型基質(zhì)膠（AC-1001007）棄掉，緩慢吹吸15mL離心管中的細胞懸液，緩慢吹吸1~2次，待細胞懸液混勻后，加入到6孔板/12孔板中鋪膠的孔內(nèi)，且補全每孔2mL/1mL的培養(yǎng)體系。

2.5  培養(yǎng)：同hPSC細胞復(fù)蘇中培養(yǎng)操作步驟；

2.6  換液：從傳代的時間開始每24h換液一次。

注意：因培養(yǎng)基中活性成分只足夠維持一天，所以每24h應(yīng)及時更換新鮮培養(yǎng)基。

hPSC細胞凍存

1. 實驗前準(zhǔn)備工作：

1.1  實驗試劑平衡： 人類多能干細胞完全培養(yǎng)基（AC-1001001）、人類多能干細胞無酶消化液（AC-1001008）以及PBS緩沖液在實驗前置于室溫中避光平衡30min~1h。

1.2  超凈工作臺/生物安全柜照射紫外：在實驗前打開紫外燈照射30min進行滅菌。

2. 實驗具體操作步驟：

2.1  清洗：拿出6孔板/12孔板棄去舊的人類多能干細胞完全培養(yǎng)基（AC-1001001），貼壁緩慢加入2mL/1mL PBS緩沖液并輕輕晃動，然后沿培養(yǎng)皿邊緣吸去 PBS緩沖液；

2.2  消化：同hPSC細胞傳代中消化操作步驟；

2.3  吹打：同hPSC細胞傳代中吹打操作步驟；

2.4  離心：待皿底的細胞全部吹下并加入到15mL離心管后，將15mL離心管置于低速離心機中配比平衡后，1000 rpm/min離心3 min；

2.5  重懸：離心后棄上清，加入1 mL Serum-free干細胞高效凍存液（AC-1001011/AC- 1001012）對干細胞沉淀進行吹吸混勻，吹吸3~5次后，將其加入到1.8mL凍存管中；

注意：凍存液即用即拿，及時放回4℃冰箱。通常生長狀態(tài)相同且同時消化的細胞統(tǒng)稱為一批細胞。

2.6  記錄：在凍存管上標(biāo)記凍存細胞種類、時間、操作者及細胞批次。

2.7  -80℃冰箱平衡：凍存管置于-80℃冰箱過夜。

 注意：凍存管放置于-80℃冰箱時，要將凍存管直立放置，切忌凍存管斜放或橫放。

2.8  液氮凍存：凍存管置于 -80℃冰箱過夜后，第2天將其置于液氮中進行長期保存。

細胞形態(tài)圖

質(zhì)量控制