注    意：正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

測(cè)定意義：

細(xì)胞色素P450酶是一組主要存在于肝臟的同工酶，在外源物質(zhì)代謝中具有重要作用，尤其是藥物和毒物的代謝。NCR作為P450酶系的重要一員，催化氧化型P450還原再生。

測(cè)定原理：

NCR催化NADPH還原氧化型細(xì)胞色素C，還原型細(xì)胞色素C在550nm處有特征吸收峰；通過(guò)測(cè)定550nm吸光度的增加速率，來(lái)計(jì)算NCR活性。

自備儀器和用品：

普通離心機(jī)，超速離心機(jī)、可調(diào)式移液槍、紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板和蒸餾水。

試劑組成和配置：

試劑一：粉劑×2瓶，4℃保存。臨用前根據(jù)用量每瓶加100mL蒸餾水充分溶解。

試劑二：液體×1瓶，4℃保存。

試劑三：粉劑×1管，-20℃保存。臨用前配制，加1.04 mL蒸餾水充分溶解，4℃保存。

試劑四：粉劑×1管，4℃保存。臨用前配制，加1100 μL蒸餾水充分溶解，4℃保存。

粗酶液提�。�

1、除去細(xì)胞核和線粒體等：稱約0.5g組織，加入4℃預(yù)冷的1 mL試劑一，冰上充分研磨，10 000g 4℃離心30min，取上清液，轉(zhuǎn)移到超速離心管中。

2、粗制微粒體：4℃，100 000g，離心60min，棄上清液。

3、除血紅蛋白等雜質(zhì)：向步驟2的沉淀中加1 mL試劑一，蓋緊后充分震蕩溶解，100 000g離心30min，棄上清液。

4、最終微粒體：向步驟3的沉淀中加試劑二0.5 mL，蓋緊后充分震蕩溶解，4℃保存待測(cè)。

NADPH-細(xì)胞色素C還原酶測(cè)定操作：

1. 分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30 min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到550 nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 試劑二在37℃水浴中預(yù)熱30min。

3. 空白管：取微量石英比色皿/96孔板，依次加入10μL蒸餾水、180μL試劑二、10μL試劑三和10μL試劑四，迅速混勻后于550nm處測(cè)定2min內(nèi)吸光值變化，第10s和第130s吸光值。△A空白管=A2-A1。

4. 測(cè)定管：取微量石英比色皿/96孔板，依次加入10μL提取液、180μL試劑二、10μL試劑三和10μL試劑四，迅速混勻后于550nm處測(cè)定2min內(nèi)吸光值變化，第10s和第130s吸光值。△A測(cè)定管=A4-A3。

注意：空白管只需做一次。

NCR活性計(jì)算公式公式：

a.使用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

（1）按蛋白濃度計(jì)算

活性單位定義：37℃中，每毫克蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1μmol還原型細(xì)胞色素C為1個(gè)酶活單位。

NCR ((nmol/min /mg prot)= (△A測(cè)定管-△A空白管)÷(ε×d)×V反總÷（Cpr×V樣）÷T

= 550×(△A測(cè)定管-△A空白管)÷Cpr

（2）按樣本質(zhì)量計(jì)算

活性單位定義：37℃中，每克組織每分鐘催化產(chǎn)生1μmol還原型細(xì)胞色素C為1個(gè)酶活單位。

NCR ((nmol/min/g 鮮重)= (△A測(cè)定管-△A空白管)÷(ε×d)×V反總÷(V樣÷V樣總×W)÷T

=275×(△A測(cè)定管-△A空白管)÷W

ε：還原型細(xì)胞色素C摩爾消光系數(shù)，19100L/mol/cm=0.0191L/μmol/cm；d：比色皿光徑（cm），1cm；V反總：反應(yīng)體系總體積（L），210μL=2.1×10^-4L；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度（mg/mL），需要另外測(cè)定；V樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積（mL），10μL=0.01mL；V樣總：提取液體積，0.5 mL；T：反應(yīng)時(shí)間（min），2min 。

b.使用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

（1）按蛋白濃度計(jì)算

活性單位定義：37℃中，每毫克蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1μmol還原型細(xì)胞色素C為1個(gè)酶活單位。

NCR ((nmol/min/mg prot)= (△A測(cè)定管-△A空白管)÷(ε×d)×V反總÷（Cpr×V樣）÷T

= 1100×(△A測(cè)定管-△A空白管)÷Cpr

（2）按樣本質(zhì)量計(jì)算

活性單位定義：37℃中，每克組織每分鐘催化產(chǎn)生1μmol還原型細(xì)胞色素c為1個(gè)酶活單位。

NCR ((nmol/min/g 鮮重) = (△A測(cè)定管-△A空白管)÷(ε×d)×V反總÷(V樣÷V樣總×W)÷T

= 550×(△A測(cè)定管-△A空白管)÷W

ε：還原型細(xì)胞色素C摩爾消光系數(shù)，19100L/mol/cm=0.0191L/μmol/cm；d：96孔板光徑（cm），0.5cm；V反總：反應(yīng)體系總體積（L），210μL=2.1×10^-4L；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度（mg/mL），需要另外測(cè)定；V樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積（mL），10μL=0.01mL；V樣總：提取液體積，0.5mL；T：反應(yīng)時(shí)間（min），2min 。

注意事項(xiàng)：

試劑三、試劑四臨用前配制，配好未使用完的4℃可保存兩天。