Western Blot實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)

 一、概述

     蛋白質(zhì)印跡法（免疫印跡試驗(yàn)）即Western Blot。它是分子生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫遺傳學(xué)中常用的一種實(shí)驗(yàn)方法。其基本原理是通過(guò)特異性抗體對(duì)凝膠電泳處理過(guò)的細(xì)胞或生物組織樣品進(jìn)行著色。通過(guò)分析著色的位置和著色深度獲得特定蛋白質(zhì)在所分析的細(xì)胞或組織中表達(dá)情況的信息。Western Blot是利用抗原抗體的免疫反應(yīng)，先將蛋白通過(guò)SDS-PAGE凝膠電泳分離開(kāi)，再利用電場(chǎng)力的作用將膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到固相載體上，然后再加上抗體形成抗原抗體復(fù)合物，再利用發(fā)光或顯色的原理將結(jié)果顯示到膜或者底片上。

     SDS-PAGE電泳的高分辨率以及固相免疫測(cè)定的特異性和敏感性保證了終實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。WB是半定量實(shí)驗(yàn)，相比較于定性實(shí)驗(yàn)有數(shù)據(jù)分析，但是需要嚴(yán)格的參照標(biāo)準(zhǔn)，因此不是準(zhǔn)確的數(shù)量關(guān)系，這也是與定量試驗(yàn)的不同之處。

二、技術(shù)流程;　

          蛋白提取-制膠-電泳-轉(zhuǎn)膜-封閉-一抗孵育-二抗孵育-化學(xué)發(fā)光-結(jié)果分析;

1.根據(jù)目標(biāo)蛋白在細(xì)胞中的位置（細(xì)胞核中，細(xì)胞漿中，細(xì)胞膜上）和目標(biāo)蛋白的性質(zhì)（變性以及非變性）選擇合適的提取蛋白的方法

2.用合適的方法例如Bradford或者BCA法測(cè)定蛋白含量

3.根據(jù)目標(biāo)蛋白的大小制作合適濃度的SDS凝膠

4.根據(jù)目標(biāo)蛋白的大小選擇合適的電泳電壓以及電泳時(shí)間

5.根據(jù)目標(biāo)蛋白的大小以及剪切的凝膠的大小選擇合適的轉(zhuǎn)膜電流以及轉(zhuǎn)膜時(shí)間

6.根據(jù)目標(biāo)蛋白的性質(zhì)選擇合適的封閉方法，例如脫脂奶粉，BSA等方法封閉

7選擇合適濃度的一抗進(jìn)行孵育，洗膜

8選擇合適濃度的二抗進(jìn)行孵育，洗膜

9 ECL發(fā)光液進(jìn)行曝光

三、客戶須知

1 檢測(cè)樣本：新鮮的組織或者細(xì)胞

2 樣本量：檢測(cè)細(xì)胞樣本的一個(gè)指標(biāo)的低細(xì)胞含量是1*106，檢測(cè)組織樣本的一個(gè)指標(biāo)的低組織樣品為30mg（建議多提供樣本，便于研磨）

3 樣本保存：

（1）新鮮的組織樣本：迅速凍存。

（2）懸浮細(xì)胞：收集完以后，冷的PBS洗3遍，吸凈殘余的液體，冷凍保存。

（3）貼壁細(xì)胞：吸凈培養(yǎng)基以后，預(yù)熱的PBS洗3遍，胰酶收集，再用冷的PBS洗3遍，吸凈殘余液體，冷凍保存；對(duì)于不適合用胰酶收集的細(xì)胞（例如胰酶處理會(huì)消化掉一部分蛋白或者對(duì)于目標(biāo)蛋白有刺激作用），預(yù)熱的PBS洗3遍以后，用細(xì)胞刮收集細(xì)胞，吸凈殘余的液體，冷凍保存。

 4、請(qǐng)?zhí)崆案嬖V我們：您樣本的種屬（人、大鼠、小鼠、兔、豬等）、樣本數(shù)量、待測(cè)指標(biāo)。

5、樣本郵寄：放入冰袋或者干冰及時(shí)寄送，建議選擇順豐快遞陸運(yùn)或者中通快遞陸運(yùn)。

四、報(bào)告內(nèi)容及標(biāo)準(zhǔn)

1  目的蛋白曝光照片一張

2  電子版目的蛋白和內(nèi)參的照片

3  灰度分析數(shù)據(jù)一份

4  蛋白含量數(shù)據(jù)

5  完整的實(shí)驗(yàn)報(bào)告（試驗(yàn)方法，試驗(yàn)參數(shù)，實(shí)驗(yàn)儀器參數(shù)）