二.樣品收集、處理及保存
1）.細(xì)胞培養(yǎng)上清：
適用于檢測(cè)體外培養(yǎng)的細(xì)胞分泌性成份。用無(wú)菌管收集細(xì)胞上清液，以1000×g離心15分鐘，收集上清。
2）細(xì)胞：
用PBS反復(fù)洗滌細(xì)胞3次，調(diào)整細(xì)胞濃度達(dá)到104-106/ml 左右，通過(guò)反復(fù)凍融，使細(xì)胞破壞并放出細(xì)胞內(nèi)成份，或者細(xì)胞超聲粉碎，離心取上清液檢測(cè)。
3）血清：
在室溫下，血液自然凝固，以1000×g離心15分鐘，取上清待測(cè)。
4）血漿：
應(yīng)根據(jù)標(biāo)本的要求選擇EDTA 或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合后靜置10-20 分鐘后，以1000×g離心15分鐘，收集上清。
5）體液：
包括胸腹水、腦脊液，分泌物等。使用不含熱原和內(nèi)毒素的離心管收集，以1000×g離心15分鐘，收集上清。
6.）組織標(biāo)本：
切取組織標(biāo)本，稱取重量0.5mg，加入500ul 的PBS，用手工或勻漿器，或超聲破碎儀將標(biāo)本勻漿，以2000-3000 rmp離心20 分鐘，收集上清進(jìn)行檢測(cè)。
樣品中不能含有NaN3，因NaN3 抑制辣根過(guò)氧化物酶的（HRP）活性。
7）保存：
如果樣品不能立即檢測(cè)，應(yīng)將其分裝，-70 ℃保存，避免反復(fù)冷凍。保存過(guò)程中如出現(xiàn)沉淀，應(yīng)再次離心。血液標(biāo)本盡可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中含大量顆粒，檢測(cè)前先離心或過(guò)濾。不要在37℃或更高的溫度加熱解凍。應(yīng)在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

三.ELISA試劑盒組成

產(chǎn)品組成	48孔配置	96孔配置	Storage
標(biāo)準(zhǔn)品：180ng/L	0.5ml×1瓶	0.5ml×1瓶	2-8℃
標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液	1.5ml×1瓶	1.5ml×1瓶	2-8℃
酶標(biāo)試劑	3ml×1瓶	6ml×1瓶	2-8℃
樣品稀釋液	3ml×1瓶	6ml×1瓶	2-8℃
顯色劑A液	3ml×1瓶	6ml×1瓶	2-8℃
顯色劑B液	3ml×1瓶	6ml×1瓶	2-8℃
終止液	3ml×1瓶	6ml×1瓶	2-8℃
濃縮洗滌液	（20ml×20倍）×1瓶	（20ml×30倍）×1瓶	2-8℃
酶標(biāo)包被板	1×48	1×96	2-8℃
封板膜	2片	2片	RT
密封袋	1個(gè)	1個(gè)	RT
說(shuō)明書	1份	1份	RT

四.操作步驟

五.實(shí)驗(yàn)原理

人膜橋蛋白(ponticulin)ELISA試劑盒 用純化的抗體包被微孔板，制成固相載體，往包被抗體的微孔中依次加入標(biāo)本或者標(biāo)準(zhǔn)品、生物素化的抗體、HRP標(biāo)記的親和素，經(jīng)過(guò)徹底洗滌后用底物顯色。底物在過(guò)氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成終的黃色。顏色的深淺和樣品濃度呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定OD值，計(jì)算樣品濃度。

實(shí)驗(yàn)過(guò)程

加樣→ 孵育→ 檢測(cè)抗體→ 顯色→ 讀數(shù) →數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)處理及報(bào)告

繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：在Excel工作表中，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度作橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)OD值作縱坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸曲線，按曲線方程計(jì)算各樣本濃度值。

六.標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制方法

可以采用各種繪圖軟件來(lái)繪制ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線，我公司以“Curve Exert1.3”軟件為例，繪制的ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線如下：

計(jì)算：以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計(jì)算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度

七.報(bào)告方式
◎定性試驗(yàn) 國(guó)內(nèi)外為便于統(tǒng)一計(jì)算，一律按S/C.O 方式報(bào)告，S 為標(biāo)本A 值，C.O 即Cut Off 值(陽(yáng)性判定值)
◎夾心法和間接法以S/C.O≥1 為陽(yáng)性；竟?fàn)幏ㄅc中和法以S/C.O﹤1 為陽(yáng)性
◎Cut Off 的計(jì)算公式以試劑盒說(shuō)明書的為準(zhǔn)常見(jiàn)的有：
◎A) C.O=2.1×N(當(dāng)N 不足0.05 時(shí)按0.05 計(jì))，
◎此公式由 P/N>2.1 換算而來(lái)，常用于夾心法。
◎B) C.O=0.5×N，從抑止率公式換算而來(lái)，
◎常用于竟?fàn)帲泻头?br />◎C) C.O=N+C(C 為常數(shù))，用于間接法。
◎D) C.O=C×P+N(C 為常數(shù))，用于間接法。此公式客觀，但對(duì)生產(chǎn)廠家要求很高，陰陽(yáng)性對(duì)照測(cè)定值要基本恒定。
報(bào)告方式
定量分析用已知量的標(biāo)準(zhǔn)品作一系列稀釋，ELISA 測(cè)定，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果以絕對(duì)量或單位表示。ELISA 的標(biāo)準(zhǔn)曲線每次都要和待測(cè)標(biāo)本做在同一塊板上。
◎現(xiàn)有的 ELISA 定量試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線只有在較窄的濃度范圍內(nèi)成直線，要得到精確的結(jié)果實(shí)屬不易。因此嚴(yán)禁用定性試劑盒做定量分析。
灰區(qū)概念
把定量分析的正常值范圍引入定性分析建立灰區(qū)概念，即將CO 值上下的一段區(qū)域定為陽(yáng)性可疑，需重復(fù)實(shí)驗(yàn)或換試劑重測(cè)以確定其陰陽(yáng)性，如仍落在灰區(qū)范圍內(nèi)則報(bào)告+(陽(yáng)性)。灰區(qū)概念對(duì)血站系統(tǒng)的獻(xiàn)血員篩查尤為重要。

人膜橋蛋白(ponticulin)ELISA試劑盒 包裝：在采樣、發(fā)送、運(yùn)輸過(guò)程中有保冷溫度要求的，公司均采用加厚款生物保溫箱，內(nèi)裝生物冰袋，有效的控制產(chǎn)品溫度，保證貨物質(zhì)量不受影響，同時(shí)并填充大量EPE發(fā)泡棉，具有優(yōu)越的緩沖彈性，它就像成千上萬(wàn)的小彈簧緊緊地保護(hù)在郵寄物品周圍，它能有效的吸收嚴(yán)酷的沖擊力，使郵寄物品免于破損，保證貨物完好送達(dá)您手。